4007787550
作者：牛志云，潘崚，刘英杰，张学军，索晓慧
【摘要】 本研究观察不同浓度藻蓝蛋白（phycocyanin）对K562细胞增殖的影响，并检测藻蓝蛋白处理后细胞表面整合蛋白β1表达和胞内黏着斑激酶（FAK）基因表达的变化，探讨整合蛋白β1在藻蓝蛋白抑制K562细胞增殖中的可能作用机制。用流式细胞术（FCM）检测藻蓝蛋白处理前后K562细胞表面整合蛋白β1表达变化；MTT法测定不同浓度藻蓝蛋白对K562细胞增殖的影响；RT-PCR检测不同浓度藻蓝蛋白对K562细胞内FAK基因表达的作用。结果表明：整合蛋白β1在K562细胞上高表达；藻蓝蛋白不能改变其表达量。不同浓度藻蓝蛋白对K562细胞的增殖均有抑制作用。藻蓝蛋白可上调胞内FAK的基因表达水平，恢复整合蛋白β1介导的细胞增殖抑制信号。结论：藻蓝蛋白可能通过增强细胞基质与K562细胞表面的整合蛋白β1结合，上调K562细胞内FAK基因表达水平，恢复整合蛋白β1介导的细胞增殖抑制信号而发挥抑制K562细胞增殖的作用。
【关键词】 藻蓝蛋白；整合蛋白；白血病； K562细胞； 细胞增殖
Effects of Integrin β1 on Phycocyanin Inhibiting Proliferation of K562 Cells
Abstract This study was purposed to investigate the effect of phycocyamin at different concentration on proliferation of K562 cells，to detect the changes of integrin β1 expression and intracellular focal adhesion kinase (FAK) gene expression on the surface K562 cells treated with phycocyanin，and to explore the possible machanism of integrin β1 effect on phycocyanin inhibiting proliferation of K562 cells. The expression level of integrin β1 on the surface of K562 cells was evaluated by flow cytometry (FCM); the growth of K562 cells treated with phycocyanin was measured by MTT assay; the expression level of FAK mRNA was analyzed by relatively quantitative RT-PCR after four-day culture of K562 cells with phycocyanin of 40 μg/ml，80 μg/ml and 160 μg/ml，respectively. The results showed that integrin β1 expression on the surface of K562 cells was significantly higher than that in bone marrow mononuclear cells (BMMNC) from normal subjects. Phycocyanin could not change the level of integin β1 expression. Phycocyanin could increase the expression of FAK gene on K562 cells and inhibit the proliferation of K562 cells. It is concluded that phycocyanin can inhibit the proliferation of K562 cells through enhancing the conjunction of cell stroma with integrin β1 on K562 cell surface，up-regulating the expression level of FAK gene in K562 cells，restoring the signaling pathway of proliferation inhibition mediated by integrin β1. The possible mechanism of phycocyanin in the proliferation inhibition of K562 cells is to increase the expression of FAK gene. The phcocyanin may be considered as a potential agent for inhibition of cancer cell proliferation.
Key words phycocyanin; integrin; leukemia; K562 cell; cell proliferation
藻蓝蛋白（phycocyanin）是螺旋藻中的一种有效成分，可提高机体的免疫力，抵抗疾病的发生［1］。研究发现，藻蓝蛋白对体外培养的HeLa、HL-60、K562以及U-937等细胞的生长有较强抑制作用［2］，但其抑制细胞生长的作用机制尚不清楚。
慢性粒细胞白血病（CML）患者体内存在的CML ph+细胞可异常增殖并逃避凋亡。研究证实，CML ph+细胞的这些特点与整合蛋白β1介导的黏附及增殖抑制功能存在障碍密切相关［3］。近年来研究表明，整合蛋白β1活化抗体8A2可明显改善CML ph+细胞的黏附功能；干扰素可通过降低ph+细胞内整合蛋白信号通路中的黏着斑激酶（focal adhesion kinase，FAK）的过度磷酸化，增加正常功能状态的FAK含量，增强整合蛋白介导的增殖抑制作用［4，5］。本研究以慢性粒细胞白血病细胞系K562细胞为研究对象，通过检测藻蓝蛋白对K562细胞的增殖影响，并观察整合蛋白β1在此过程中所发挥的作用及FAK基因表达的改变，探讨藻蓝蛋白是否通过恢复整合蛋白β1的功能而发挥其抑制肿瘤细胞增殖作用的。
材料和方法
细胞系与试剂
CML急变期细胞系K652细胞由河北医科大学细胞生物教研室惠赠，正常人的骨髓单个核细胞（BMMNC）和CML急变期病人BMMNC采自临床标本。鼠抗人整合蛋白β1单克隆抗体和羊抗鼠荧光抗体FITC购自苏州Coulter公司。胎牛血清、RPMI 1640培养液和四甲基偶氮唑蓝（MTT）购于华美公司。藻蓝蛋白由衡水博生生物公司惠赠，用前以无菌三蒸馏水稀释成所需浓度。小鼠IgG同型对照抗体购自鼎国生物公司。TRIZOL RNA提取液、随机引物、M-MLV逆转录酶及TaqDNA聚合酶、dNTP等PCR反应体系均购自华美生物工程公司。FAK引物由Primer 5.0软件设计，北京赛百盛基因技术有限公司合成。
悬浮培养模型的建立
K562细胞置于含10％胎牛血清的RPMI 1640培养液中，于37℃、5％ CO2及饱和湿度下培养。取对数生长期细胞，以5×106／ml细胞接种于24孔板。藻蓝蛋白终浓度分别为40 μg/ml、80 μg/ml和160 μg/ml。
K562细胞整合蛋白β1表达水平的流式细胞术测定
收集对数生长期细胞并调整细胞密度为5×106／ml，取细胞悬液100 μl，一组加10 μl抗整合蛋白β1（CD29）单克隆抗体，另一组加小鼠IgG为同型对照，轻微混匀，4℃避光放置30分钟；离心去上清，用冷PBS洗涤2遍，去除多余抗体；分别加入羊抗鼠FITC二抗10 μl 及冷PBS 100 μl，吸打混匀，4℃避光放置30分钟；用冷PBS洗涤后将细胞重悬于200 μl冷PBS中，混匀并移至流式专用管内，应用FACS Calibur流式细胞仪检测整合蛋白β1表达阳性的细胞率，应用CellQuest软件分析数据。
不同浓度藻蓝蛋白对K562细胞增殖影响的MTT比色法测定
取对数生长期的浓度为5×106／ml的K562细胞悬液，按每孔1 ml接种到24孔平底培养板中，设3个藻蓝蛋白浓度实验组（40 μg/ml组、80 μg/ml组、160 μg/ml组），每组各设6个平行孔，连续培养1-6天后进行检测。从24孔板中每孔移取50 ml细胞液于96孔板的相应孔中，另外设阴性对照组。于培养结束前4小时在96孔板中每孔加入1 0 μl MTT溶液（5 mg/ml），离心弃上清，加入200 μl DMSO，充分溶解结晶物，然后用酶标仪测490 nm处吸光度A值，绘制细胞生长曲线。细胞增殖抑制率＝（1－处理组A值／对照组A值）×100％。
RNA提取和浓度测定
分别离心收集各组K562细胞，用TRIZOL抽提总RNA。用2％琼脂糖凝胶电泳鉴定提取的RNA的完整性并观察其降解情况，在紫外分光光度仪上测定RNA样品A260 和A280比值。再用DEPC水将各组总RNA调整至同一浓度。
各组K562细胞内FAK mRNA表达水平的RT-PCR检测
20 μl逆转录体系中含50 μg/ml随机引物1 μl，5×逆转录反应缓冲液4 μl，10 mmol/L dNTP 2 μl，50 U/μl RNasin 0.5 μl，M-MLV逆转录酶15 U，余用DEPC水补足20 μl。于37℃、60分钟逆转录2 μg总RNA中的mRNA为cDNA，95℃ 反应5分钟后终止反应。使用50 μl反应体系同时扩增目的基因和GAPDH基因，具体循环参数如下： 94℃预变性2分钟进入循环，94℃变性40秒，54℃退火1分钟，72℃延伸1分钟，经40个循环扩增后72℃延伸10分钟。GAPDH基因上游引物：5’-CGGGAAGCTTGTGATCTT TGG-3’； 下游引物：5’-GGCATGGATGGCATGGACTGA-3’；引物扩增片段长度为358 bp。FAK上游引物：5’-TTGCGGAGAATATGGCTGACCTAA-3’； 下游引物：5’-TGGTATTGATGGCAAAGCCCGTTC-3’； 引物扩增片段长度为116 bp。取10 μl RT-PCR产物及10 μl DNA marker进行1.5％琼脂糖凝胶电泳，采用MULIT IMAGE凝胶图像分析仪进行吸光度扫描，观察条带的灰度强弱，结果以目的基因与GAPDH的积分吸光度的比值表示。
统计学处理
数据均以均数±标准差（ X±SD）表示，利用SPSS 10.0软件进行统计分析。多组间均数差异性比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA）中LSD检验，P＜0.05即认为有统计学意义。
结果
K562细胞高表达整合蛋白β1
经FCM测定，正常人BMMNC和K562细胞整合蛋白β1(CD29)阳性表达率分别为72.40±3.56%和99.24±0.52%，后者较前者明显增高（P<0.05）。CML急变期病人BMMNC整合蛋白β1阳性表达率为93.43±1.67%，较正常人组显著增加（P<0 05）。这些结果表明，K562细胞和CML病人BMMNC整合蛋白β1表达升高。藻蓝蛋白处理后K562细胞整合蛋白β1阳性表达率与未处理组比较无明显改变（图1）。
藻蓝蛋白抑制K562细胞增殖
MTT检测结果显示，各浓度藻蓝蛋白处理组的K562细胞增殖抑制率较对照组均显著升高（P<0.01），并呈剂量依赖性的变化；且以藻蓝蛋白孵育4天对K562细胞增殖的抑制作用最明显，40、80和160μg/ml组第4天细胞抑制率分别为24.76％±4.96％、37.95％±5.13％和46.61％±2.64％（附表）。Tabel . Inhibition rate of phycocyanin （PC） with different concentrations on K562 cells analyzed by MTT test （略）
各组K562细胞的总RNA提取和鉴定
各组总RNA用紫外分光光度仪测定其A260 和A280 比值，结果显示比值均在1.8-2.0范围，证实了总RNA的完整性。1.5%琼脂糖凝胶电泳可见5S、18S、28S 3条特征带，且28S条带含量约是18S条带的2倍，上样孔周围无明显EB染色出现，表明无降解和DNA污染，纯度附合要求。
藻蓝蛋白对K562细胞内FAK mRNA表达水平的影响
检测结果如 图2所示，各组PCR产物条带的FAK/GAPDH光密度比值分别为：0.40（对照组）、0.88（40 μg/ml组）、1.03（80 μg/ml组）、0.91（160 μg/ml组）和1 36（正常人BMMNC）。与正常人BMMNC比较，K562细胞内FAK基因表达明显降低；不同浓度藻蓝蛋白处理4天后K562细胞内FAK基因表达明显增加，但各浓度组间无剂量依赖性。
讨论
藻蓝蛋白是螺旋藻的重要组分之一。研究表明，藻蓝蛋白有较高的生理活性和药用价值，如防治肿瘤，提高机体免疫力，促进动物血细胞再生等［6］。本实验再次证实了藻蓝蛋白抑制肿瘤细胞生长的作用。我们发现，藻蓝蛋白对人白血病细胞株K562细胞增殖的抑制作用与细胞表面的整合蛋白β1的功能相关。为了阐明其作用机理，我们做了进一步研究。
FCM结果显示，在CML急变期病人的BMMNC和K562细胞表面整合蛋白β1均高表达，而藻蓝蛋白并不改变其表达量。业已证明，整合蛋白β1的高表达与CML祖细胞中的P210融合蛋白的刺激有关，且P210蛋白对其正常信号的转导有抑制作用。此外，Lundell等［7］通过克隆形成实验发现，ph+细胞的整合蛋白介导的生长抑制信号转导功能存在缺陷。因此我们推测，藻蓝蛋白可能通过改善整合蛋白β1的功能缺陷，而非改变其表达量发挥作用。为了证实这一点，我们检测了藻蓝蛋白处理组K562细胞内FAK的基因表达水平。
众所周知，FAK处于整合蛋白信号通路与生长因子信号通路的交汇点，在生长因子受体系统与整合蛋白协同调节细胞的活化、增殖、凋亡等活动中发挥重要作用［8］。它是一种胞内非受体型酪氨酸蛋白激酶，参与了细胞内多种信号转导途径，并在信号转导中起承上启下的作用［9］。RT-PCR检测结果表明，K562细胞与正常人BMMNC相比，FAK基因表达水平明显降低。藻蓝蛋白处理后K562细胞内FAK基因表达水平显著增加。因此我们推测，藻蓝蛋白可能通过抑制P210融合蛋白诱导FAK发生过度磷酸化，提高胞内具有正常功能的FAK表达量和活性，而恢复整合蛋白β1信号通路对CML ph+细胞增殖的负调控。此结果与常铉等［5］的实验结果一致，从而证实恢复整合蛋白β1对CML ph+细胞的增殖抑制功能是治疗CML的有效途径之一。同时本研究也证明，藻蓝蛋白的确有抗肿瘤的功效，是一种很有开发潜力的药物。
