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红细胞(red blood cell,RBC)作为机体血液的主要细胞组分,其主要功能是运输O2和CO2。红细胞结构的特殊性使其较其他细胞更易遭受自由基攻击,发生氧化损伤。首先,红细胞膜富含不饱和脂肪酸;其次胞内的主要成分是血红蛋白,富含铁,而铁是催化自由基反应的有效剂;最后,红细胞无线粒体,细胞核等细胞器使其发生损伤后无修复能力。红细胞发生氧化损伤后结构功能均会发生变化。首先,ROS会攻击红细胞胞内的主要成分--血红蛋白,使其氧化,转变为高铁血红蛋白(Methehemoglobin,Met Hb),红细胞失去携氧能力影响组织氧供;同时血红蛋白氧化会使珠蛋白交联形成二硫键,沉积在细胞膜内侧,影响膜流动性。其次,ROS攻击红细胞膜,会使膜脂质过氧化,膜蛋白交联,最终导致膜流动性降低,硬度增加从而降低红细胞变形性。总而言之,ROS攻击会破坏红细胞的结构和功能。在多种生理病理条件下红细胞都易发生氧化损伤。如运动性氧化应激会引起红细胞氧化损伤,降低血液供氧能力,加深组织缺氧从而影响机体的运动能力和恢复过程;体外接触过多的氧化剂,如铁氰化合物或苯胺颜料等会使血红蛋白氧化,形成高铁血红蛋白症,影响组织氧供;辐射引起体内自由基增多,红细胞膜脂质发生过氧化,渗透性增强,最终会导致溶血。由此可见红细胞氧化损伤引起的结构功能变化会对机体产生一定的危害,其防治十分必要。目前常使用抗氧化剂对氧化损伤进行防治。常用的抗氧化剂包括内源性抗氧化剂(如维他命E、维他命C等)和外源性抗氧化剂(主要是植物提取物,如红景天、复方天葡片等)。由于机体内存在许多自由基反应形态,自由基间可以转换,单一的自由基清除剂如VE、Vc等不能有效的阻断多态链式反应。植物提取物,如红景天等疗效确切,但作为外源性抗氧化剂,植物提取物作用缓慢,通常需要在发生氧化损伤前使用至少5天,有时甚至需要使用长达20天,这种缓慢的作用机制限制了它们在抗红细胞急性氧化损伤上的使用。另外,植物提取物的成分不单一,对提取工艺要求较高,并且其作用机理较为复杂。因此我们期望寻找一种内源性的、成分单一的小分子化合物,用于红细胞氧化损伤防治。丙酮酸钠(sodium pyruvate,SP)是丙酮酸的钠盐。丙酮酸是一种内源性的小分子化合物,是糖代谢途径中的关键中间产物,处于有氧代谢和无氧代谢的交汇处,可以进入三羧酸循环,代谢终产物是二氧化碳和水,也可以在无氧酵解中被转变为乳酸。丙酮酸钠本身具有抗炎、抗氧化、多器官保护和纠正酸中毒等作用。研究表明,丙酮酸钠在失血性休克液体复苏、脑损伤和缺血再灌注损伤模型中能够保护器官功能,同时改善机体或器官氧化应激状态;另外丙酮酸钠在防治糖尿病引起的白内障、保护胰岛细胞避免锌中毒损伤等许多与氧化损伤密切相关的疾病治疗中也取得一定成效。但是其对红细胞氧化损伤保护作用至今未有报道。值得注意的是,使用含有丙酮酸钠的复壮液对储存血进行洗涤,发现能够恢复红细胞ATP水平,改善红细胞功能。综上所述,丙酮酸钠既是能量代谢底物同时具有抗氧化的作用,针对红细胞特殊的结构,我们认为其对红细胞氧化损伤能起到更好的保护作用。因此本研究拟在体外建立合适的红细胞氧化损伤模型,研究丙酮酸钠对红细胞氧化损伤的保护作用,并对其保护作用机制进行探讨。第一部分:建立和筛选合适的红细胞氧化损伤模型采用大鼠红细胞建立氧化损伤模型,并对吩嗪硫酸甲酯(phenazine methosulfate,PMS)、过氧化氢(hydrogen peroxide,H2O2)、亚硝酸钠(sodium nitrite,Na NO2)等三种氧化剂的作用效果进行筛选。颈动脉采集大鼠血液,离心去除白细胞,获得红细胞重悬液后分为四组:对照组;PMS组(终浓度为25、50和100μM);H2O2组(终浓度为0.5、5和8 m M);Na NO2组(终浓度为0.5、1和1.5 m M)。其中,H2O2组中还需加入终浓度为0.4 m M叠氮化钠(sodium azide,Na N3)溶液以防止加入的过氧化氢被酶解。37°C水浴1h,用自体血浆调节红细胞压积至40%,测定红细胞氧化损伤的主要指标Met Hb含量以及聚集性、变形性等血液流变学指标。结果表明:三种氧化剂作用红细胞后,与基础值相比Met Hb含量均显著升高(P0.05),说明三种氧化剂均使红细胞产生一定程度的氧化损伤。在红细胞聚集指数方面,H2O2组随浓度升高呈下降趋势,并在浓度为8 m M时与对照组相比具有统计学差异(P0.05);各浓度的PMS和Na NO2对红细胞聚集指数均无明显影响(P0.05)。在红细胞聚集时间上,与对照组相比,H2O2作用浓度为5 m M和8 m M时聚集时间明显升高(P0.05);PMS对聚集时间无明显影响;Na NO2作用后聚集时间降低(P0.05),但随着作用浓度升高聚集时间呈回升趋势,在浓度为1.5m M时与对照组比无统计学差异。在红细胞变形性方面,H2O2和PMS作用红细胞后,不同剪切速率(shear rate,SHR)下的红细胞变形性与对照组相比均显著下降(P0.05);Na NO2作用红细胞后,SHR≤100 s-1时,变形性降低(P0.05),但随着SHR的增大,红细胞变形性有升高趋势,SHR≥600 s-1时,Na NO2组变形性显著高于对照组(P0.05)。小结:Met Hb含量和红细胞变形性等流变学指标是评价红细胞氧化损伤的相关指标,其中Met Hb含量反应胞内血红蛋白的状态,与红细胞携放氧能力相关,红细胞变形性等流变学指标与膜氧化后流动性相关。本部分研究结果显示:三种氧化剂作用红细胞均能引起Met Hb水平升高,证明其均造成一定程度的氧化损伤。但是三种氧化剂对红细胞流变学特性影响大不相同,其中Na NO2可上调红细胞变形能力,这可能与其作为NO供体的特性有关。由此可见Na NO2作为氧化剂一方面可使红细胞Met Hb含量升高,造成红细胞氧化损伤;但另一方面,它又可改善红细胞变形能力,对红细胞起双向调节的作用,其机制较为复杂,因此我们认为Na NO2诱导的红细胞氧化损伤模型不适用于后续的研究,故选择PMS和H2O2作为主要氧化剂进行后续的红细胞氧化损伤模型制备。另外根据Met Hb含量确定后续研究中PMS作用浓度为50μM,H2O2作用浓度为8 m M。第二部分:丙酮酸钠对红细胞氧化损伤的保护作用应用第一部分筛选的氧化剂种类及浓度建立红细胞氧化损伤模型,并验证丙酮酸钠对红细胞氧化损伤的保护作用。颈动脉采集大鼠血液,离心去除白细胞,获得红细胞重悬液。首先对丙酮酸钠作用浓度进行筛选(分组为5、10、20、50和100 m M),通过作用前后Met Hb、丙二醛(malondialdehyde,MDA)和还原型谷胱甘肽(reduced glutathione,GSH)等的变化确定丙酮酸钠合适的作用浓度。随后观察不同浓度丙酮酸钠对红细胞的保护作用。将红细胞重悬液分为两组:PMS模型组和H2O2模型组。其中每一模型组又设置不同的作用条件,包括:对照组、氧化损伤组、丙酮酸钠不同浓度预处理组等。首先向丙酮酸钠预处理组加入相应浓度丙酮酸钠,37°C作用30 min,随后根据分组加入相应氧化剂于37°C作用1h。检测相关指标变化,其中PMS组检测指标包括Met Hb、MDA、GSH、GSH/GSSG比率和谷胱甘肽还原酶(glutathione reductase,GR);H2O2组检测指标有Met Hb、MDA、GSH。结果表明:不同浓度丙酮酸钠作用红细胞后,Met Hb无明显升高,与对照组比无显著差异(P0.05);MDA随作用浓度升高明显下降(P0.05),但在丙酮酸钠为100 m M时回升;GSH含量随作用浓度升高呈上升趋势,但与对照组相比无显著差异(P0.05),在丙酮酸钠为100 m M时有所下降。结果提示,低浓度丙酮酸钠对红细胞无明显副作用,100 m M的作用浓度下各指标异常提示可能该浓度偏高。故确定丙酮酸钠作用浓度为5、10、20、50 m M。使用筛选的浓度观察丙酮酸钠对红细胞氧化损伤的保护作用。结果表明PMS作用红细胞后,与对照组相比,Met Hb、MDA含量升高(P0.05),GSH、GSH/GSSG下降(P0.05),GR无明显变化(P0.05)。丙酮酸钠预处理可以显著降低PMS诱导的MDA水平,且在浓度为20 m M和50 m M时与PMS损伤组相比具有统计学差异(P0.05);还可升高GSH/GSSG比率,并呈剂量效应关系,各个浓度处理后GSH/GSSG比率与PMS损伤组相比均具有统计学差异(P0.05);但丙酮酸钠预处理对PMS引起的Met Hb和GSH变化无明显影响(P0.05)。H2O2作用红细胞后,与对照组相比,Met Hb、MDA显著升高(P0.05),GSH显著下降(P0.05)。丙酮酸钠预处理可以显著降低H2O2诱导的Met Hb和MDA水平,与H2O2损伤组相比均具有统计学差异(P0.05);同时能升高GSH水平,在丙酮酸钠浓度为20 m M和50 m M时,与H2O2损伤组比具有统计学差异(P0.05)。
小结:通过实验选择丙酮酸钠作用浓度为5、10、20、50 m M进行保护作用研究。丙酮酸钠均能够降低PMS和H2O2诱导的MDA含量,表明丙酮酸钠对这两种氧化剂造成的红细胞氧化损伤均具有一定程度保护作用;但是丙酮酸钠对PMS诱导的Met Hb升高无明显影响,却能降低H2O2诱导的Met Hb水平,这可能与两种氧化剂不同的作用机制有关,这也提示我们丙酮酸钠在H2O2引起的红细胞氧化损伤模型中保护作用较明显。因此,在后续的实验中选用H2O2诱导的氧化损伤模型研究丙酮酸钠对红细胞保护作用的机制。第三部分:丙酮酸钠对红细胞氧化损伤的保护作用机制探讨以H2O2造成的红细胞氧化损伤模型为主要研究对象,探讨丙酮酸钠对红细胞氧化损伤保护作用的机制。颈动脉采集大鼠血液,离心去除白细胞,获得红细胞重悬液。将红细胞重悬液分为:对照组,即没有任何处理;H2O2损伤组,即只进行氧化损伤诱导;保护组,即采用不同浓度丙酮酸钠预处理后再诱导氧化损伤,丙酮酸钠作用浓度分别为5、10、20、50 m M。首先向保护组加入相应浓度丙酮酸钠,37°C作用30 min,随后向损伤组和保护组加入H2O2,于37°C作用1 h。检测相关指标变化,包括ROS生成量,红细胞功能指标P50,糖代谢指标2,3-DPG(2,3-diphosphoglycerate)、ATP水平和Na+-K+ATP酶活力以及代谢关键酶乳酸脱氢酶(lactate dehydrohenase,LDH)活力。结果表明:与对照组相比,H2O2作用红细胞后,ROS水平上升,2,3-DPG和P50下降,ATP含量下降,Na+-K+ATP酶和LDH活力受到抑制(P0.05)。丙酮酸钠预处理可以减少ROS含量,在浓度为50 m M时与损伤组比有统计学差异(P0.05);与损伤组相比,丙酮酸钠浓度为10 m M和20 m M时可明显恢复LDH活性(P0.05);各个浓度丙酮酸钠预处理均可升高ATP水平(P0.05);浓度为20 m M和50 m M的丙酮酸钠可明显恢复Na+-K+ATP酶活力(P0.05),升高2,3-DPG水平(P0.05),还可提高P50(P0.05)。小结:首先,丙酮酸钠能够抑制ROS生成,直接降低H2O2对红细胞的损伤;其次,丙酮酸钠能够提高LDH活力,促进红细胞糖酵解途径,恢复ATP水平,减轻红细胞氧化损伤。丙酮酸在转换为乳酸的过程中能够升高NAD+/NADH,NAD+升高有助于2,3-DPG生成,因此我们认为丙酮酸钠可促进2,3-DPG支路进行,提高2,3-DPG产量。作为糖酵解途径中一个侧支循环的产物,2,3-DPG是调节血红蛋白携放氧功能的重要因素。2,3-DPG可与脱氧血红蛋白结合,降低血红蛋白对O2的亲和力,增加氧的释放。本实验也表明丙酮酸钠预处理能够升高2,3-DPG含量,从而升高P50,改善红细胞功能,发挥红细胞保护作用。丙酮酸钠对红细胞不同的糖代谢途径起效浓度不一致,可能与各途径在细胞中所占比例不同有关。综上所述,本研究结果表明丙酮酸钠对红细胞的氧化损伤具有保护作用,并且其可分别通过调节糖酵解途径及2,3-DPG支路,改善红细胞功能、减轻红细胞氧化损伤。本研究可为红细胞氧化损伤相关疾病的防治提供新的思路和理论基础。
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