NBT即氯化硝基四氮唑兰 (Nitroblue tetrazolium chloride)，为深蓝色无定形微溶物质。BCIP即5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸盐(5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl Phosphate), 在碱性磷酸酶（Alkaline phosphatase,AP）的催化作用下，BCIP会被水解产生强反应性的产物，该产物会和NBT发生反应，形成不溶性的深蓝色至蓝紫色的沉淀。

使用说明：

1. 取40ul 25×NBT 加入到1ml 1×AP反应缓冲液中，混匀后，再加入40ul 25×BCIP混匀，即配成反应工作液，此反应液最好现配现用。

       注意：根据膜的大小，1×AP反应缓冲液、25×BCIP、25×NBT的量可以等比例扩大。

2. 把经洗涤的PVDF/NC膜浸入反应工作液中，于室温平缓摇动进行温育。

3. 当蛋白带的颜色深度达到要求（一般约20-30分钟）时，把膜浸入去离子水中停止反应。

注意事项：

   BCIP、NBT为可疑致癌物，请采取必要的防范措施。操作时应戴手套，尽量避免与皮肤接触，用后及时彻底冲洗。