吖啶橙(Acridine Orange，AO)属于三环杂芳香燃料，可以标记DNA、RNA，属于异染性荧光染料。该染料具有膜通透性，能透过细胞膜，使核DNA和RNA染色。因此AO常用于细胞内DNA和RNA进行检测。AO与核酸结合方式主要有：1、插入性结合，AO嵌入核酸双链的碱基对之间，这种结合方式主要为AO与DNA的结合，其荧光发射峰为530nm，激发后呈绿色荧光；2、静电吸引，带正电荷的AO与单链核酸的磷酸根(带负电荷)产生静电间的吸引结合，这种结合方式主要为AO与RNA的结合，其荧光发射峰为640nm，激发后呈红色荧光，少量结合会呈桔黄色或桔红色荧光。因此，吖啶橙嵌合到双链DNA分子中显绿色，与DNA单链或RNA结合时发桔黄色或橙红色荧光。 

吖啶橙染色试剂盒(Acridine Orange Detection Kit)主要由AO Stain、AO Stain Buffer组成，常用于细胞凋亡的检测。染色后在荧光显微镜下观察，吖啶橙可透过正常细胞膜，使细胞核呈绿色或黄绿色均匀荧光；而在凋亡细胞中，因染色质固缩或断裂为大小不等的片断，形成凋亡小体。吖啶橙使其染上致密浓染的黄绿色荧光或黄绿色碎片颗粒；而坏死细胞黄荧光减弱甚至消失。吖啶橙染色常与EB染色合用双染，EB只染死细胞使之产生桔黄色荧光，由此可区分出正常细胞、凋亡细胞及坏死细胞。

1、 荧光显微镜 

2、 低速离心机 

3、 PBS

4、 细胞计数板 

5、 载玻片、盖玻片 

操作步骤(仅供参考)：

(一) AO单独染色

1、 收集细胞(采用流式细胞仪检测时，应先固定细胞)，用AO Stain Buffer(1×)清洗细胞1次，加入适量的AO Stain Buffer(1×)重悬细胞，计数并调节细胞浓度至106/ml。 

2、 取适量的细胞悬液和AO Stain，按照细胞悬液：AO Stain=19：1的比例混合，轻轻混匀。如果采用荧光显微镜下观察，一般取95μl细胞悬液和5μl AO Stain混合即可。 

3、 室温避光染色15min，滴加于载玻片上并加盖玻片或上流式细胞仪分析。 

4、 荧光显微镜下观察(激发滤光片波长488nm，阻断滤光片波长515nm)，计数并拍照。 

染色结果：

正常细胞 

细胞被均匀染成黄绿色荧光 

凋亡细胞 

染色质浓缩，细胞核碎裂成点状，被染成大小不一、致密浓染的绿色颗粒 

(二) AO/EB双染色 

1、 收集细胞，用AO Stain Buffer(1×)清洗细胞1次，加入适量的AO Stain Buffer(1×)重悬细胞，计数并调节细胞浓度至106/ml。 

2、 取适量的细胞悬液和AO Stain，按照细胞悬液：AO Stain=19：1的比例混合，并加入适量EB染色液，轻轻混匀。如果采用荧光显微镜下观察，一般取95μl细胞悬液和5μl AO Stain混合即可。 

3、 室温避光染色15min，滴加于载玻片上并加盖玻片 

4、 荧光显微镜滤光片515nm观察，计数并拍照。 

染色结果：

正常细胞 

均匀染成绿色荧光 

坏死细胞 

细胞桔黄色荧光 

凋亡细胞 

染色质浓缩，细胞核碎裂，被染成大小不一、致密浓染的黄绿色颗粒或见胞质芽状突起。 

计算细胞凋亡率和死亡率:

细胞死亡率=凋亡细胞/细胞总数×100%   细胞坏死率=坏死细胞/细胞总数×100%

注意事项：

1． 吖啶橙染色常不EB染色合用，可区分出正常细胞、凋亡细胞及坏死细胞。 

2． 如有低温离心机进行离心效果更佳，同时应注意减少试剂暴露于强光下的时间。 

3． 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。